CLA-NGS細(xì)胞鑒定

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案例展示

▏ 背景

細(xì)胞系錯誤鑒定（例如物種不符或細(xì)胞類型不符）是生物醫(yī)學(xué)研究中的普遍問題。多國（包括美國、英國、德國、日本等）主要細(xì)胞庫的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，高達(dá)18%至36%的細(xì)胞系存在錯誤。國際細(xì)胞系認(rèn)證委員會（ICLAC） 2021年報告明確列出了576種被錯誤鑒定的細(xì)胞系，涉及144種交叉污染源。

據(jù) PLOS ONE(2017) 研究估計(jì)，因使用錯誤細(xì)胞系而需撤回或受到質(zhì)疑的科研論文已超過 32,000篇。無效研究及藥物開發(fā)失敗更造成超 500億美元的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙科研進(jìn)展。

圖 1. 使用細(xì)胞系作為腫瘤模型的數(shù)據(jù)生成場景（EMBO 雜志 (2022)41:e111307）

中美冠科生物科技公司（CrownBio）自主研發(fā)的深度測序CLA技術(shù)，徹底革新細(xì)胞系鑒定標(biāo)準(zhǔn)，科佰生物作為冠科深度測序（CLA with Deep Sequencing）細(xì)胞鑒定技術(shù)全國獨(dú)家代理，為您提供從技術(shù)咨詢到檢測報告的一站式解決方案，下文將深度解析CLA技術(shù)如何為您的科研與藥物開發(fā)保駕護(hù)航。

▏ 傳統(tǒng)多重PCR STR檢測及其局限性

目前，細(xì)胞系鑒定的傳統(tǒng)方法是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分型技術(shù)。該技術(shù)利用特異性引物擴(kuò)增多個（通常為9-24個）具有個體間長度多態(tài)性的STR位點(diǎn)，生成獨(dú)特的DNA“指紋”圖譜，用于識別細(xì)胞系身份和追蹤樣本來源。

然而，該方法存在顯著局限性：
檢測位點(diǎn)有限：僅覆蓋9-24個STR位點(diǎn)（取決于試劑盒），區(qū)分能力不足。
區(qū)分近緣樣本困難：對遺傳高度相似的樣本（如近交系小鼠細(xì)胞、同源腫瘤譜系）準(zhǔn)確性低。
MSI干擾：MMR基因突變導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI），引發(fā)遺傳漂變、污染細(xì)胞過度生長及STR誤判。 靈敏度不足：理論靈敏度5-10%，實(shí)際應(yīng)用中有時無法檢出高達(dá)20%的污染。
鼠細(xì)胞鑒定困難: 在小鼠細(xì)胞系中表現(xiàn)不佳（如研究顯示42個樣本僅21例結(jié)果一致，PLOS ONE, 2019）。

案例：

1. B16-F0、B16-F1等衍生細(xì)胞系STR匹配度>90%，無法區(qū)分。

Parental Cell Line	Derivative of parental cell line	Percent Matching
NCTC clone 929	A9	85%
WEHI 164	WEHI-13VAR	91%
CT26.WT	CT26.CL25	87%
B16-F0	B16-F1	94%
RAW 264.7	RAW 264.7 gamma NO-	95%

表1：使用 Master 算法對已知相關(guān)細(xì)胞系的匹配百分比

2.混合污染樣本無法通過STR峰圖解析（如小鼠-人交叉污染）。
如果樣本由多種細(xì)胞系混合組成，則無法將干擾過濾器應(yīng)用于數(shù)據(jù)集，因?yàn)槎鄠€貢獻(xiàn)者可能在譜圖中產(chǎn)生不同的峰高，從而導(dǎo)致干擾過濾器失效。

▏ 深度測序（CLA with Deep Sequencing）技術(shù)

基于靶向測序600+ SNP位點(diǎn)及染色體片段的深度測序（3000X覆蓋）與智能分析，深度測序（CLA with Deep Sequencing）技術(shù)可同步實(shí)現(xiàn)細(xì)胞系高精度鑒定、微量污染檢測（1%靈敏度）及多維度遺傳解析。

核心優(yōu)勢：
靶向測序：使用含 600+ SNP 和染色體片段的面板，結(jié)合 3000X 高深度測序，精準(zhǔn)描繪遺傳特征。
智能分析：依托先進(jìn)生物信息學(xué)，不僅能檢出 SNP，更能分析其頻率，提供深度信息。
高通量能力：單次運(yùn)行可處理數(shù)百樣本，遠(yuǎn)超傳統(tǒng) STR 的低通量。
多功能一體：兼具傳統(tǒng) STR 不具備的功能：檢測病毒/支原體污染、鑒定人類性別等遺傳特征、追蹤遺傳漂變與系統(tǒng)發(fā)育、精確定量混合樣本污染。

基于此，NGS 已成功構(gòu)建大型 SNP 指紋庫（如涵蓋 >1200 種人癌細(xì)胞系和 30 種小鼠細(xì)胞系），點(diǎn)擊此處查詢SNP指紋庫信息。

下表比較了用于細(xì)胞系認(rèn)證的深度測序CLA和基于PCR的STR檢測：

檢測項(xiàng)目	深度測序CLA	基于PCR的STR檢測
技術(shù)	條形碼深度測序	多重 PCR 和毛細(xì)管電泳
檢測的 DNA 位點(diǎn)數(shù)量	600+	通常 9 至 24 個 (取決于供應(yīng)商)
讀出類型	數(shù)字型 (清晰，接近零的定量誤差)	模擬型 (有噪聲，高定量誤差)
污染檢測靈敏度	高 (1%)	低至中 (5-20%)
準(zhǔn)確性	高	低至中
通量	高	低
人類樣本鑒定	支持	支持
小鼠樣本鑒定	支持	有限
支原體檢測	支持	不支持
病毒感染檢測	支持	不支持
污染比例定量	支持	不支持
種間污染檢測	支持	不支持
種內(nèi)污染檢測	支持	有限
人類樣本群體結(jié)構(gòu)推斷	支持	不支持
人類樣本性別檢測	支持	不支持
適用于大型生物樣本庫	支持	不支持
追蹤遺傳漂變并構(gòu)建樣本系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系	支持	不支持
適用于無參考樣本的污染	支持	不支持